T载体与目的基因连接成功，测序结果也正确。从新摇菌，提取质粒，在进行双酶切，一直切不下来？

解决办法：1、cla1是一个比较不常见的酶，可能酶切体系和ECOR1的缓冲体系不一样，试着分别酶切，就是先切cla1，然后纯化后切ECOR1；或者查找哪个酶的酶切效率高些，那个后切；2、3个小时可能太短了，我一般都是5个小时，或者过夜；3、可能是你菌挑错了，或污染了，重新调菌或者把原来构建成功的质粒进行转化，再酶切。

希望对你有帮助。